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疫苗

发布时间:2019年04月09日

摘要

几个世纪以来,疫苗一直被用来保护人们和动物免受传染病的侵袭。对于疫苗生产来说,细胞培养技术被认为是一个关键的里程碑,也是几十年来发展的结果。细胞基质的开发和实施使病毒疫苗的大规模和安全生产成为可能。对新出现的病毒性疾病的疫苗需求,不断增长的疫苗生产量,以及疫苗生产严格的安全规则,使得细胞基质成为病毒疫苗生产的主要生产基地。在这篇综述中,我们主要研究用于生产抵御病毒性疾病的人用疫苗的细胞基质。根据疫苗的性质,细胞基质的选择是至关重要的。生物制药公司在开发新的候选疫苗一般会在早期阶段首先评估不同的细胞基质,以便选择最适用于大规模生产的细胞基质。首先,疫苗的安全性是监管机构重点关注的问题,细胞基质必须符合严格的监管规则;其次,细胞基质在病毒特异性产量和生产成本方面须是有竞争力。因此,能够利用多种细胞基质对疫苗生产来说是必要的,因为只有这样才能成功地满足当前和未来对新出现或再发生的传染病疫苗的需求(如流感疫苗,埃博拉病毒,基孔肯雅病毒的爆发)。

1.疫苗开发中细胞基质的历史

 

通过对比国家疫苗接种计划实施前后的传染病医疗费用,很好地证明了疫苗对人类和动物的保护潜力。随着时间的推移,疫苗生产技术有了显著的进步,带来了更高的生产率和更加安全和更具免疫原性的疫苗生产。

本文将聚焦于用于生产人用病毒疫苗的细胞基质,这些病毒都有复制能力(如减毒活疫苗、重组嵌合疫苗,和灭活疫苗)。细胞基质是近几十年来活跃研究的成果,已被应用于提高产品安全性,满足人们对疫苗日益增长的需求,降低了相关的生产成本。

1.1. 疫苗生产技术的演变

最初的疫苗来源于病人和被感染的动物。Jenner的首次预防接种是将挤奶女工手上牛痘病灶的脓液接种给一个8岁的男孩。从那时起,到二十世纪初,疫苗主要是使用动物组织产生的,如从兔子、绵羊或山羊、幼崽脑(小鼠、大鼠、兔)中提取,或使用被感染动物的血清。

自20世纪30年代以来,已开发出使用含胚鸡蛋在实验室中培育病毒的方法,并用于生产和制造人用和兽用疫苗。目前鸡胚仍被大量使用,特别是在季节性流感疫苗的生产中。然而,使用鸡胚造成了一些限制,包括有供应不足的风险,生产过程耗时而产量不高,高昂的生产成本,和鸡蛋成分潜在的过敏反应。

为了克服鸡胚的局限性,细胞培养技术被引入,比传统的生产工艺有了更高的灵活性。在疫苗领域第一个标志事件,是Jonas Salk 在1954使用猴肾细胞,来生产脊髓灰质炎疫苗。此后,最早的细胞基质的使用,如原代鸡胚成纤维细胞,为疫苗(如麻疹、腮腺炎)生产提供了巨大的便利。原代细胞直接来源于动物,不储存,或在一定程度上作为细胞库。由于其有限的传代能力,每个疫苗生产批次都必须要重新新制备原代细胞,然后原代细胞培养面临被污染的风险,因此引发了市场担忧。

疫苗需求不断增加和对安全性的要求越来越高,迫切需要开发出更安全,更经济,更高效的用于生产疫苗的细胞基质。最早的基于这个目标而开发的细胞基质既包括二倍体和无限细胞系(表1)。二倍体细胞系,如人肺源系MRC5(医学研究理事会5)和WI-38细胞(Wistar研究所),是从原代培养得到的。他们有一个正常或接近正常的染色体组型,但传代培养能力有限,最终衰老并停止复制。相反,无限细胞系,如MDCK细胞和Vero细胞,显示出无限的自我更新能力,可以随时从细胞库系统用于生产,允许广泛的特征和无限的细胞群再现性。由于他们无限期的寿命,无限细胞系能够适应现代细胞培养技术(如培养容器,大型发酵罐,微载体、片状载体培养,和介质)。然而,由于持续传代,遗传变异可能发生,导致细胞基质生成致瘤表型。例如,Vero细胞系在高传代次数(传代162次)显示遗传不稳定性和潜在的致瘤性。因此,只有传代次数少的非致瘤性Vero细胞可用于疫苗生产,这可能导致细胞基质由于广泛应用而造成种子源不断减少的问题。

这些限制,结合细胞系开发出的新技术,促进了新细胞系的建立,包括所谓的“designer” 细胞系。已经探索出几种方法来获得当前可用的新的细胞基质,包括选择压力(如悬浮的MDCK细胞系;鸭胚胎干细胞来源的EB66® 细胞)或基因修饰(如人类视网膜来源的PER.C6®细胞系,鸭视网膜来源的AGE1.CR®细胞,和人类羊水细胞来源的CAP®细胞)。这些细胞基质已开发出特定的用途,如基因治疗中的腺病毒生产(PER.C6® 细胞系)或流感疫苗生产,并得到了广泛生物学表征,以满足监管法规和生物安全的要求。长期且耗资巨大的开发过程,以及紧张的市场竞争压力,阻碍了新细胞基质针对每种疫苗的开发和表征。因此,目前可用的细胞系被用来作为生产新疫苗最佳选择。表1总结了应用于疫苗领域得最常见的细胞基质,它们的主要生物学特性和特征显示在表2和表3中。

 

1.2.选择标准--用于制备病毒疫苗的细胞基质

选择一个细胞基质是开发和生产候选病毒疫苗的重要步骤,做出选择依赖于一些参数(如细胞敏感性和能否裂解性感染,病毒抗原的质量和产量方面的性能,细胞最主要的持续传代性,伦理观点,肿瘤发生性状态,贴壁依赖性生长还是可悬浮培养,培养基,生产成本,无外源性物质等)。选择细胞基质还须考虑到疫苗的设计(例如灭活疫苗还是减毒活疫苗:管理途径;预防性还是治疗性疫苗)。最后,安全性和产业化考虑深刻地影响着合适的/最理想的细胞基质的选择。在本文第2部分和第3部分中会进一步详细说明。

 

2.监管方面的考虑

2.1.疫苗安全性监管法规要求的演变

由于第一代疫苗采用动物组织生产,监管机构(RAs),制造商和公共卫生当局的主要关注点,是疫苗产品中存在外源性物质或细胞成分,如脱氧核糖核酸(DNA)或转化蛋白。事实上,几个重大的污染案例在上个世纪已证实:如在1960 用于生产脊髓灰质炎疫苗的猴肾细胞(恒河猴肾细胞[ RMK ])中发现猿猴病毒40(SV40);在用含有细菌噬菌体的牛血清生产出的减毒活疫苗中识别到细菌病毒;最近,在轮状病毒疫苗中检测到猪环病毒序列(Rotarix和RotaTeq®®)。

科技的进步和更强大的分析方法的运用,能够证实以前检测不到的或未知的污染物。因此监管机构(RAs)实施了新的生产和控制实践,编制了行动指南。行动指南的基本原则是:疫苗的质量,安全性,效价,纯度和功效依赖于基于风险评估的综合方法,该方法影响原材料和初始材料的选择和表征,中间和最终的质量控制,主要包括制造过程的设计和验证。特定的行动指南到位并定期修订,提供生产建议,包括疫苗生产用细胞基质的选择,表征以及维护。特别地,指导方针已经发展到考虑到与新的细胞基质有关的问题,包括“designer”细胞系,这些细胞系通常表现出致瘤表型。鸭胚胎干细胞来源的EB66® 细胞系是个有趣的例子。按照当前版本欧洲药典(EP)的5.2.3章节,用致瘤细胞系制备活疫苗是被禁止的。然而,EB66用于生产这些疫苗已经被认为是适合的,预先作了变更的欧洲药典(EP),将与世界卫生组织(WHO)2013年公布的正式建议,协调一致。

2.2.用于生产病毒疫苗的细胞基质的特性

无论细胞类型(如原代细胞,二倍体,干细胞,或者连续传代的细胞)还是所要生产的疫苗类型,细胞基质,必须规范记录,充分表征,并取得相应的资质。

对于所有类型的细胞,根据良好生产规范(GMP)和良好的细胞培养实践(GCCP)的一般原则,制备一个主细胞库(MCB)和工作细胞库(WCB)被认为是最佳实践,以确保可靠的和一致的细胞供应,这些细胞在用于生产前须完全特征化并通过安全性测试。细胞库存储在长期稳定的条件下,如液氮或超低温冰箱,并定期测试,以证明其表型和基因型特征的可持续性。细胞基质的试验程序依赖于风险评估,考虑到:(1)细胞基质的来源:物种和组织来源;(2)细胞基质的历史:分离方法、测试结果或对捐献者的监测表现,传代历史,使用的原材料,动物体内的传代历史;(3)细胞基质的特点:细胞生长特性,生化,遗传和细胞遗传模型,,以及传染性因素的测试结果;(4)致瘤性和致癌活性评估。

最后,必须评估细胞基质与疫苗病毒之间的相容性。由于选择压力可以改变细胞培养传代过程中病毒的基因型或更多的表型,必须证明疫苗病毒的稳定性。

2.2.1.细胞基质来源

细胞基质的来源,是潜在污染源考量的关键因素。污染物的特性根据细胞基质的起源物种而变化。例如,鸟类,尤其是鸡,可能导致逆转录病毒的污染,如禽类白血病病毒、网状内皮增生病毒,或细菌如gallisepticum支原体或synoviae支原体,而犬种可能导致的污染物包括犬瘟热病毒和犬类腺病毒。

组织类型传代方法同样也须考虑。比如,来自肿瘤的细胞可能有致癌的病毒序列存在,如人宫颈癌Hela细胞含有人类乳头状瘤病毒18的DNA 。由腺病毒5型DNA转化而来的细胞也有这种情况,如人胚胎肾细胞293(HEK-293)和 PER.C6®细胞系。

2.2.2.细胞基质的历史

细胞基质的历史开始于分离或衍生,应包括详细的医学史或人类供体的病原体情况,不管是人源的还是动物来源的细胞基质。在衍生过程中使用的原材料必须是可追溯的,包括在细胞培养前处理或培养中所使用的任何生化试剂(如细胞、病毒)。此外,还必须建立程序,以减少由于细胞基质从供体中分离而带来的污染风险,包括外源性物质,改编,工程处理或克隆。

人源或动物来源的原料的使用,完整地记录和分析以免带来潜在的污染物。由于疯牛病(BSE)出现于上世纪80年代,须特别注意来自牛和猪的原料(例如牛血清和猪胰蛋白酶等)。欧盟委员会公布了一份指导文件,适用于来自“可遗传的海绵状脑病(TSE)相关动物物种”的任何材料,用于准备原材料和启动生产所需的材料,包括制备工作细胞库(WCB)或新的主细胞库(MCB)

2.2.3.细胞基质的特性及外源性物质的检测

主细胞库(MCB)和工作细胞库(WCB)的特征描述必须足够广泛。表4给出了一个基于世卫组织指导的具有代表性的生物安全测试方案。生产企业根据国家的监管当局的要求给出特征化项目的定义,再根据细胞的历史和类型制定测试策略。测试内容包括特征调研试验,纯度,稳定性,和无菌(如染色体组型、同工酶的基本信息,DNA指纹鉴定,生长速率,特定染色体的存在,或表面标记,非病毒测试:细菌、真菌、支原体与分枝杆菌,病毒测试:包括体外细胞培养测试,细胞病变和血细胞吸附/红细胞凝聚病毒使用不同的细胞系并在几个物种进行动物体内实验,逆转录病毒测试,如透射电子显微镜(TEM)和逆转录酶增强(PERT)试验)。推荐对物种特定性的外来病毒进行检测,存在于亲本体内或在衍生过程使用的原材料中;也须测试潜在病毒的存在(DNA病毒和内源性逆转录病毒)通过化学诱导物。已知的或未知的病毒可能使用新的方法来发现,例如大规模测序和基因芯片技术。由于技术的挑战,如化验标准化和验证,数据解释,调查阳性结果的策略,以及生产阶段的选择,这些新技术直到现在才被推荐使用。

2.2.4.致瘤性和致癌性的评估

自上世纪90年代,就开始讨论使用永生化和肿瘤细胞系来生产病毒疫苗。细胞基质瘤相关的主要问题是诱导癌细胞转移,已知或未知病毒的转移,致癌剂或细胞成分的转移可能引发肿瘤。因此,所有二倍体(特征化良好的MRC-5和WI-38除外)和连续细胞系都要进行致瘤活性的描述,因为细胞会随着传代次数的增加而获得致瘤活性。完整的细胞注射到遗传免疫缺陷的动物(例如裸鼠,多种联合免疫抑制(SCID)小鼠,或通过抗胸腺细胞球蛋白,抗胸腺细胞的淋巴细胞或血清而获得的T细胞功能失活的免疫缺陷动物)后,形成肿瘤,这样的细胞被定义为致瘤细胞。

细胞基质的致瘤表型可通过肿瘤形成的动力学来评估,单个实验动物的细胞剂量为107, 105,103和10个,至少观察4个月。试验动物50%的致癌剂量(TPD50 )的测定、肿瘤发展所需的时间、形成肿瘤并转移的能力是必须进行评估的参数,对于一个给定的细胞基质。目前的理解是一个较低的50%的致癌剂量(TPD50 )(形成肿瘤在101-104个细胞/动物;样本中包括HeLa细胞),有很高的风险诱发肿瘤发展。在这方面对细胞基质或产品的可接受性没有一般的规则,而是在监管机构(RAs)的准则里有具体问题具体分析的论述。

疫苗生产使用致瘤性和肿瘤来源的细胞,要求必须进行致瘤性研究。使用细胞DNA(≥100µg)和细胞裂解物(来源于107细胞)注射到新生动物(如<3日龄)裸鼠、新生仓鼠和新生大鼠体内进行致瘤性研究。至少4个月后检测试验动物体内结节形成的证据。在观察期的末尾,在注射部位检测肿瘤形成以及转移性病变的证据。

管部门目前的态度是:使用肿瘤细胞系或肿瘤来源的细胞系生产疫苗,细胞DNA和外源性物质会带来主要的安全性隐患。因此,生产中需要对细胞基质中的外源性物质进行广泛的特征界定,并在生产过程中采取策略清除。

 

3.生产

细胞基质的选择不仅涉及疫苗生产的安全方面,而且还涉及大规模生产方面的考虑,以低成本达到高产量。

3.1.工艺开发

3.1.1.细胞培养法生产病毒

已开发许多工艺,使用贴壁依赖性细胞系在转瓶或多层细胞培养系统中生产疫苗。(例如Rotarix® , Varivax® , Meruvax®)然而成本、占地面积和人工成本等限制因素使得这些技术无法大规模应用。然而,也有新的选择,如显著改进的固定摇床系统,搅拌式生物反应器里的微载体系统也使得贴壁细胞能有更大的生产规模。在控制良好的悬浮培养系统中,整个过程由于比表面积的增加,占用空间显著减少,降低了劳动强度。这一优势激发了对此技术的进一步开发;因此针对目前所生产的疫苗,不同的细胞类型已有各种粘附材料和客户订制的工艺设计可供使用。然而,微载体细胞培养系统仍然是一个技术上的挑战(例如控制剪切力),成本昂贵操作繁琐(如放大过程的细胞分离)。新一代的悬浮细胞系,如MDCK, PER.C6®,EB66® 或AGE1.CR®能够解决这些问题,实现无微载体的培养,降低生产成本,提供生产效率,简化细胞培养步骤。

每种细胞基质有其自身特点,包括营养需求(葡萄糖、谷氨酰胺等)、代谢控制、剪切敏感性,氧需求、遗传稳定性、副产物代谢(乳酸、铵离子等),最适温度、pH、渗透压等。细胞基质生产过程监测选西尔曼科技M900生化分析仪就够啦!因此,优化培养基以确保细胞生长和病毒生成在整个工艺建立中起着至关重要的作用。在少数情况下,特定的病毒生产培养基能优化病毒的生长。

通常,疫苗生产培养基中含有胎牛血清(FBS),但它们的批间不稳定性是众所周知的,常常导致工艺不一致的问题。安全问题,波动的成本水平和血清短缺风险等额外的约束,限制了胎牛血清(FBS)的使用。这鼓励疫苗生产走向无动物成分的细胞培养,促进了无血清培养基的发展。培养基的开发和生产往往是外包给培养基供应商(如 Lonza, HyClone, SAFC, Irvine-Scientic等等),这些供应商能选择最佳的培养基配方,满足生产目标,符合GMP规范和监管要求。有效的培养基开发程序采用综合互补的策略,包括成分滴定,混合培养基,在线培养基分析、代谢流分析和高通量筛选等方法。

在生物反应器系统中,可以应用不同的细胞培养程序。最广泛的是分批补料培养法,该方法包括在培养过程中分批多次补加浓缩feed或碳源(葡萄糖和谷氨酰胺)。这样可以更好地控制细胞的生物量和生产病毒的能力。由于有毒的代谢副产物积累且难以分离,健康细胞的维持护是有限的。灌流细胞培养方式能不断更新新鲜培养基和收获产品,从而能维持更长时间的培养,这特别适合复制慢的病毒。作为一个基本的工艺开发策略,细胞的连续的培养系统Frensing等人开发,运行中包含稳定和持续供应的细胞。应用连续培养的理念,在限定的条件下会生产出更高产量的疫苗,从而有利于减少生产设备的投入。这种方法已经被用于流感病毒的生产。

3.1.2病毒的纯化

在过去的几十年里,大量的技术进步显著增加了病毒生产工艺的生产率和可扩展性。相比之下,由于回收率通常很低,病毒纯化技术仍须提升,特别是由于严格的监管规则下,对疫苗产品中宿主细胞的污染物有强制要求。事实上,许多纯化步骤是必要的,细胞裂解,粗滤和精滤去除细胞碎片,浓度和控制措施,层析过滤或区带离心,纳滤灭菌。总的来说,这些连续的操作造成了病毒颗粒的大量损失,占疫苗生产成本的主要部分。为了提升效率和可扩展性,新的技术不断地出现,病毒颗粒的纯化成为疫苗生产领域重大的技术诀窍。

病毒疫苗的纯化工艺取决于所生产的病毒疫苗的类型、用于病毒生产的细胞基质以及单一剂量的病毒数量。相应地,宿主细胞蛋白质和DNA的污染水平也要有明确界定。对于非致瘤性的连续细胞系,如 Vero细胞,宿主细胞DNA(HCD)每注射剂量里的含量须少于10纳克。对于致瘤的细胞系,HCD数量的限制更为严格,有待国家监管机构(NRAs)讨论加以确定。

为了证明符合监管要求,纯化后的原料药分析包括无菌/支原体检测、产品识别和效力以及量化的生产工艺误差(如牛血清白蛋白,抗生素,benzonase,HCD,和蛋白质)。在疫苗产品中,残余HCD使得疫苗安全问题尤为严峻。在动物模型中使用克隆的细胞癌基因表明细胞DNA带来致瘤转化转化的风险很低,因此传染性风险远大于致癌风险。残余的HCD相关的风险,可以通过核酸酶消化和纯化步骤(如层析)来降低,这些方法能够减少DNA片段的大小,使之小于功能基因的长度(约200 bp),从而减少药物产品中DNA的数量。

3.2. 基于细胞技术的疫苗生产展望

新型细胞培养技术的出现,引发了对传统设施设计和生产线的再考虑,以提供更高的生产资产利用率。疫苗生产企业确实面临着不断变化的商业环境所带来的新商机。发展中国家不断增长的需求,以及疫苗产品的积累落入公共领域,促使疫苗产业有更高的反应性,灵活性,运营成本的降低,以保证经济可持续性。现在的挑战是以更智能的方式生产更便宜的疫苗,同时对生产高质量的产品保持坚定的承诺。面对这一现实,疫苗生产商必须处理昂贵且不适应的业务资产。这带来了工程学和超大固定设备(如不锈钢反应器)以及生物制造产业几十年来继承的发展而来的复杂设施布局。

新的概念带来了更快的建设和疫苗设施的调试,新局面也带来了资本和运营支出的减少。Galliher 和 Pralong提出了一个新的范例,他们画出了高度模块化设备的轮廓,作为保证快速高效生产的最好方式,为了新的市场而部署,以较低的成本生产出多种产品。该解决方案包括使空间更灵活,降低运营成本,通过一次性设备和预组装模块单元部件的广泛使用。不锈钢设备意味着昂贵的费用和较长的产品周转时间,由于操作基础设施的复杂性预先灭菌的一次性使用单元(一次性生物反应器,和纯化套件)模块化设施,将使设备生产周转加快,在一个给定的空间生产多种产品成为可能。虽然最初的投资成本是可以预期的,但这保证了生产设备适应产量需求,从而优化了设备的利用率。生产模式策略也将对这些改进产生重大影响。整合“上游”和“下游”步骤的全连续工艺模式,将超越传统的批量生产策略提供更高的效率。这一新的生产系统有以下优势:工艺流程之间没有停顿,压力较小的细胞培养环境因为养分是恒定的且有毒的副产物被丢弃了;较高的细胞量提供更高的产量,直接而持续的纯化步骤提高了产品质量。目前没有这样完全整合的生物工艺系统可用于生产病毒疫苗,尽管有激动人心的尝试和改进分别在“上游”和“下游”得以实现。

 

4.结语

用于病毒疫苗生产的新型细胞基质的引入和建立是麻烦的,整个过程耗时且需要高昂的成本。所以时至今日仍然只有相对少量的细胞基质能用于疫苗生产。疫苗生产的发展趋势是要从鸡胚跨越到细胞基质,新建立了的且经过验证的细胞基质是引人关注的。因此,多样化的现代细胞基质保证了高标准的疫苗供应,不仅现在如此也关乎未来。

令人满意的可用于疫苗生产的细胞基质会显示“industrial-friendly”的特性:对多种(且范围广泛)病毒来说是易感染的(表1),能够无限增殖,在较短的时间能增至到很高的细胞密度,并且易于扩展容(表3)。此外,由于细胞基质被认为是疫苗制剂的一个组成部分,因此必须根据许多安全和法规要求进行广泛的表征,这些要求(表2)不断演变。

总之,在选择细胞基质开发新的疫苗前,必须考虑很多方面。这里需要重点强调的是目前没有细胞基质能满足所有标准。因此,考虑和客观评价不同的细胞基质,为每种新的疫苗选择最佳细胞平台是必不可少的步骤。

 

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